Slaapziekte

Inleiding

Tropische ziekten zijn infectieziekten die min of meer enkel voorkomen in gebieden met een tropisch of subtropisch klimaat. Jaarlijks sterven er miljoenen mensen aan deze ziekten.
Zo heb je gele koorts, dat wordt overgebracht door de mug Aedes aeaegypti.
Dit virus komt in tropische gebieden van Afrika en Zuid-Amerika voor.
Een ander infectieziekte is malaria dat door eencellige parasieten wordt veroorzaakt. Jaarlijks sterven er ongeveer 1 miljoen mensen hieraan. Ongeveer 40% van de wereldbevolking leeft in gebieden waar malaria voorkomt.
Dan heb je ook nog de intestinale wormen die meer dan 1,2 miljard of 20% van de wereldbevolking infecteren, zo heb je nog veel meer tropische ziekten.

Ik ga me in mijn onderzoek specificeren in slaapziekte of de Humane Afrikaanse Trypanosomiase, omdat deze ziekte niet helemaal bekend is in Europa

Hoofdstuk 1 Wat is slaapziekte?

1.1 De parasiet
De parasiet, Trypanosoma brucei, is eencellig en beweegt zich voort door middel van een flagel. De parasiet bezit een cel en een kern van mitochondrion, daarin ligt het DNA partikel dat zeer groot is. De parasiet nestelt zich in het bloed, tussen de weefsels en in de hersenen.

1.2 De vector
Slaapziekte is een vectorziekte: de verspreiding is (gedeeltelijk) afhankelijk van vliegen.
De vector is een organisme dat de parasiet overbrengt op een ander organisme en het zo infecteert, het veroorzaakt de ziekte zelf niet. In dit geval is het de tseetseevlieg, het is tweemaal zo groot als een gewone huisvlieg. Slecht 1% van de vliegen zijn besmet met trypanosomen. De tseetseevlieg voedt zich met bloed van zoogdieren en reptielen.
Wanneer de vlieg steekt spuit ze eerst speeksel in het organisme om bloedklontering te voorkomen wanneer ze het bloed opzuigt.

Besmetting kan op verschillende manieren:
• Vlieg besmet mens: tenzij de vlieg al besmet is zal ze ook de mens besmetten bij het inspuiten van het speeksel. De trypanosoom vermenigvuldigt zich en komt in het bloed terecht.
• Mens besmet vlieg: wanneer een niet geïnfecteerde vlieg een geïnfecteerde mens steekt en bloed opzuigt zal ze dus ook trypanosomen opzuigen. De trypanosomen ondergaan een transformatie zodat ze in leven kunnen blijven in de vlieg die veel minder glucose heeft dan de mens. In dit geval is de vlieg ook besmet.
• Moeder besmet kind: een geïnfecteerde moeder geeft via haar bloed ook trypanosomen door aan de foetus, dit kan zorgen voor een natuurlijke abortus of voor een baby die ziek geboren wordt als hij al overleefd.
• Mens besmet mens: als bloed van een geïnfecteerde mens in aanraking komt met een wond van een niet-geïnfecteerde persoon dan krijgt hij ook de slaapziekte.
Tseetseevliegen zitten vaak laag op vegetatie nabij water. Niet in open terrein met weinig water en veel wind.
De vlieg vindt zijn prooi doordat het wordt aangetrokken tot twee zaken:
 Reuk: chemische stoffen die mensen en dieren afscheiden: ketonen, alcoholen, fenols en carbondioxide.
 Zicht: kleur (zwart en blauw), grootte (hoe groter hoe beter) en positie (horizontaal beter dan verticaal)
De vectoren vliegen 20 km/h en zijn 30 minuten per dag actief. Na een steek produceert de mens antistoffen, maar trypanosomen kunnen zich voortplanten en telkens van gedaante wisselen. Zo wordt het afweersysteem van een besmette persoon uitgeput.
Een wijfje copuleert slecht eenmaal in haar leven. Een volgroeide larve verlaat de vrouwtjesvlieg en graaft zich snel in de grond om er te verpoppen.


1.3 De ziekte
1.3.1 Cyclus

1. Vlieg steekt en gaat speeksel inspuiten tegen klontering van het bloed. De parasiet komt in het lymfevocht en komt zo in de bloedbaan terecht.
2. De parasiet past zich aan het bloed van de mens en verspreid zich zo verder in het bloed.
3. De parasieten gaan delen en getransporteerd worden naar andere delen van het lichaam zoals in het spinaal vocht.
4. Door het vele delen van de parasiet gaan ze zichtbaar worden in het bloed en kan er een diagnose gesteld worden.
5. Een andere tseetseevlieg neemt nu besmet bloed van de geïnfecteerde mens op en kan zo de ziekte overbrengen op andere organismen.
6. In de vlieg transformeren de trypanosomen zich in 'procyclic trypomastigotes'. Dit gebeurt door veelvoudige binaire splitsing.
7. Deze 'procyclic trypomastigotes' verlaten de darm van de vlieg, en transformeren in 'epimastigotes'
8. Deze 'epimastigotes' bereiken de speekselklieren van de vlieg en blijven zich door binaire splitsing vermenigvuldigen.
De cyclus in de vlieg duurt ongeveer 3 weken.


1.3.2 Vroeg stadium
De parasiet bevindt zich in het bloed en in het lymfevocht. Volgende symptomen kunnen voorkomen:
• Ontstoken zweer ter hoogte van de beet.
• Lokaal huidoedeem
• Gezwollen lymfeknopen in de hals.
• Opgezette lever en milt.
• Opgezet aangezicht.
• Onregelmatige koortsaanvallen
• Eetstoornissen
• Hormonale stoornissen (amenorrhee, impotentie, koude gevoel,…)
Deze symptomen komen ook voor bij malaria en daarom maakt men veel fouten door mensen die besmet zijn met trypanosomen eerst tegen malaria te behandelen.

1.3.3 Laat stadium
De parasiet bevindt zich nu in de hersenen, volgende symptomen komen voor:
• Slaapstoornissen
• Verstandsverlies (prettig gestoord of agressief)
• Staren

• Progressieve aftakeling
• Apathie
• Ongecoördineerde bewegingen
• Spierslapte (incontinentie)
• Ongecontroleerde spraak
• Coma
• Dood



1.4 Verspreidingsgebied

Je hebt twee soorten slaapziekten:
- Trypanosoma brucei gambiense: dit is de West-Afrikaanse slaapziekte (Angola, Dem.Rep, Kongo, Oeganda en Soedan). Deze ziekte kan jaren duren.
- Trypanosoma brucei rhodesiense: dit is de Oost-Afrikaanse slaapziekte(Malawi, Zimbabwe, Zambia, Tanzania en Oeganda, dit is het enige land waar het twee voorkomen). Dit gaat veel sneller en is in enkele maanden al fataal, de meeste patiënten sterven aan een hartaanval (hartzakjes disfunctioneren).
300.000 – 500.000 mensen lijden aan slaapziekte en 300.000 mensen sterven hieraan.

De mensen in Afrika zijn afhankelijk van vrijwilligers uit Europa en Amerika.

1.5 Geneesmiddelen
Gambiense Rhodesiense
Vroeg stadium Pentamidine Suramine
Laat stadium Melarsoprol
Eflornithine
Efurtimox

Om resistentie tegen te gaan worden de geneesmiddelen onderling gecombineerd.
Er bestaat geen vaccin tegen slaapziekte.
Alle medicatie hebben serieuze bijwerkingen bijvoorbeeld dat het vel ontsteekt en eraf valt ( zeer gevaarlijk omwille van hygiëne).

1.6 Preventie
Aangezien er geen vaccins bestaan tegen eencellige is de beste preventie:
- Het vermijden van tseetseevliegen.
- Kleren dragen van stevig materiaal die armen en benen volledig bedekken, omdat de tseetseevlieg door dun stof kan steken. Men moet ook kleuren dragen die niet opvallen bijvoorbeeld kaki en olijfgroen, omdat tseetseevliegen vooral worden aangetrokken door zwart en blauw.
- Insectwerende middelen gebruiken en onder een muskietennet slapen.

- Alvorens in een voertuig te stappen controleren of ze tseetseevliegvrij zijn. Niet in een open voertuig rijden want de opwaaiende stof daarachter trekken de vliegen aan.
- Niet te dicht komen bij struikgewas.

1.7 Controle van de ziekte
1.7.1 Vectorcontrole
• Vliegen bestrijden met insecticiden.
• Vliegenvallen zetten in dichtbebouwde bossen, niet te hoog en niet in open terrein.
• Uitzetten van steriele tseetseemannetjes. Ze worden door gammastralen gesteriliseerd en terug vrijgelaten.
• Habitat van tseetseevliegen vernietigen.

1.7.2 Reductie van dierlijke reservoir
Een van de redenen waarom men slaapziekte niet kan uitroeien is omdat men niet kan zien wanneer een dier besmet is. De tseetseevlieg kan dus altijd trypanosomen van een dier naar een mens blijven overbrengen. Er zijn er bij de dieren wel een paar uitzonderingen:
- Een hond wordt blind als hij besmet is.

- Een Buffalo is min of meer resistent. De parasiet in de Buffalo verdwijnt na enkele dagen.
- De trypanosoma dat gevaarlijk is voor de mens is niet gevaarlijk voor een varken.
- Trypanosomen die schadelijk zijn voor de mens zijn niet schadelijk voor muizen.
Dus om een beetje controle te hebben over de ziekte gaat men bijvoorbeeld wilde dieren in Tanzania uitroeien en opsporen en behandelen van ziek vee.

Hoofdstuk 2 Labo’s

2.1 Polymerase chain reaction
Benodigdheden:

• 40 µl buffer
• 40 µl PCR ( koel bewaren zodat de parasieten niet dood gaan )
• een dipstick
• een pipet

Werkwijze:

PCR-reactie:
De PCR reactie bestaat uit 3 verschillende fasen:
• Een temperatuursverhoging waardoor het DNA denatureert. Het denatureren van DNA is het verbreken van de waterstofbruggen in de helixstructuur. De 2 enkelstrengs DNA moleculen zijn nu van elkaar.
• Daarna worden er primers toegevoegd. Primers zijn kleinere stukjes DNA van synthetische oorsprong die ongeveer een 100-tal mononucleotiden bevatten. De basenvolgorde in de primers zijn complementair met die van het enkelstrengs DNA. Primers zorgen ervoor dat de DNA fragmenten opnieuw aan andere basen gekoppeld worden.
• Ten slotte wordt de reactie voltooid door toevoeging van het enzym polymerase. Het enzym is enkel werkzaam bij een lagere temperatuur, daarom moet het eerst worden afgekoeld. Dit enzym zorgt ervoor dat de primers worden verlengd tot een volledig stuk DNA. Door toevoeging van mononucleotiden gaat het enzym zorgen dat ze gebonden worden aan het enkelstrengs DNA. Er ontstaat een helixstructuur.

Opmerking: omdat dit moet gebeuren bij verschillende temperaturen, hebben wetenschappers onderzoek gedaan naar een enzym dat niet temperatuursgevoelig is.
De bacterie, Thermicus aquaticus, die men gevonden heeft is niet temperatuurgevoelig en kan de reactie sneller verlopen.

Proef:

40 µl buffer wordt gemengd met 40 µl PCR met een pipet en in een potje gebracht. Wanneer het mengsel gemaakt is wordt er een dipstick ingestoken. Na 5 minuten wachten kijken we op de dipstick naar enige veranderingen.

Waarnemingen:

Bij de ene dipstick verkleurt er op de voorste zijde een rode streep. Bij de andere dipstick verkleurt er niets op de voorzijde, maar op de achterzijde wel een rode streep.

Verklaringen:

Wanneer er op de voorste zijde van de dipstick een rode streep verkleurt, dan is er DNA van de parasiet aanwezig. De dipstick bevat een probe, die probe bevat een Au-deeltje, en avidine, een kleefstof. De parasieten bevatten biotine, dat is een stof die aangetrokken wordt door avidine.
Wanneer de gouddeeltjes in het mengsel van buffer en PCR komen dan komen ze vrij. Ze gaan binden op de parasieten. Ze migreren naar boven tot aan de plaats waar avidine aanwezig is op de dipstick. Biotine en avidine gaan nu aan elkaar kleven zoals magneten. De rode kleur verschijnt wanneer de probe zich bindt met avidine. Deze kleur kan eventueel veranderd worden door kleurstoffen toe te voegen.

Wanneer er geen parasieten aanwezig zijn gaan de gouddeeltjes naar beneden zakken en kunnen zich niet binden. De gouddeeltjes vallen in het mengsel en slaan neer. Er verkleurt op de voorzijde geen rode streep, maar op de achterzijde wel. Dit is een controle dat de proef werkelijk is uitgevoerd. In het mengsel zit ook nog ander DNA dat aangetrokken wordt op de dipstick. Zo kan men controleren of er niets mis is aan de dipstick.


Besluit:

Men is positief wanneer er een rode streep verkleurt op de dipstick, men is dus geïnfecteerd met de parasiet. Men is negatief wanneer er op de voorzijde van de dipstick geen rode kleur verschijnt en op de achterzijde van de dipstick wel een rode streep verkleurt.
Het is een eenvoudig praktiserend onderzoek voor het opzoeken van de parasieten, dat men op het terrein zelf kan doen.


2.2 CATT test
Benodigdheden:

• CATT antigeen
• CATT buffer (fosfaat buffer)
• Gevriesdroogde geiten serum (neg. controle)
• Gevriesdroogd eiwit (pos. controle)
• Schudmachine
• Spuitjes
• Druppeltellers
• Bloedstaal (10 personen)
• Microlancet
• Testzone (kaartje)
• Stokje voor verspreiding over testzone
• Microlancet om bloed te prikken
• Capillairen
• Cappillairenrekje
• Afvalbuis

Werkwijze:

Om de CATT test te kunnen uitvoeren moet men over enkele bepaalde dingen beschikken waaronder: het CATT antigeen (2.5ml/vial) dat bestaat uit gevriesdroogde gekleurde trypanosoom parasieten, een CATT buffer (30ml) specifiek een fosfaatbuffer waarvan de pH 7.2 bedraagt; deze buffer wordt gebruikt voor het oplossen van het CATT antigeen voor de pos. en neg. controle; deze positieve controle kan men uitvoeren door de aanwezige gevriesdroogde geitenserum en de negatieve controle bestaat uit gevriesdroogd eiwit.
Voor men aan de proef kan beginnen moet men eerst enkele zaken voorbereiden.

Deze voorbereiding bestaan uit het regelen van snelheid van de schudmachine, deze moet namelijk op 60 toeren per minuut staan. Daarna 2.5ml CATT buffer aan het flesje toevoegen met antigeen.

Tot slot moet men ook 0.5ml CATT buffer aan het flesje met controle toevoegen en vervolgens op beide flesjes een druppelteller plaatsen.

Eerst wordt een controle van het CATT antigeen uitgevoerd; deze bestaat uit verscheiden stappen waaronder 1 druppel positieve en negatieve controle te laten vallen op de testzone en daaraan een druppel CATT antigen toevoegen die men vervolgens mengt met een stokje om zo alles over de testzone te verspreiden en dit alles laat men 5 minuten schudden op de schudmachine.

Om de bloedstalen te maken wordt de middenvinger van een patiënt gedesinfecteerd en aan de rechterbinnenkant, een prikje gegeven met een microlancet. De eerste bloeddruppel moet worden afgeveegd.
Aan het bloed wordt een capillair gehouden, door capillariteit vloeit het bloed zo in het buisje. Het buisje eens schudden en vervolgens worden alle buisjes achter elkaar gerangschikt in het capillairenrekje.

Na de voorbereidingen worden de bloedstalen die men heeft afgenomen van de patiënten op een testkaartje gedruppeld. Aan deze bloeddruppels wordt er een druppel CATT antigen toegevoegd. Wanneer elk bloedstaal CATT antigen bevat wordt het verspreid over de testzone. Na elke strijk wordt het stokje afgekuist.
Daarna wordt het testkaartje op de schudmachine geplaatst die 60 toeren per minuut schudt.

Waarnemingen:

Wanneer men positief is ontstaat er na het schudden klonters en als er niets gebeurt, heeft men de slaapziekte niet.

Verklaringen:

Bij de bloedstalen met klonters zijn trypanosomen aanwezig. Het antigen bindt op de trypanosoom en zo vormen er zich klonters. Bij de bloedstalen waar niest veranderd, zijn er geen trypanosomen aanwezig en zo kunnen er ook geen klonters gevormd worden.

Besluit:

Deze techniek is een zeer eenvoudige, gemakkelijk uitvoerende methode om trypanosomen terug te vinden. Deze kan uitgevoerd worden in Afrika waar niet veel luxe en elektriciteit aanwezig is. De schudmachine kan eventueel op batterijen worden geschakeld.


2.3 Micro haematokriet centrifugatie techniek
Principe:

Men gaat een preparaat maken om bloed van een patiënt te onderzoeken omdat deze waarschijnlijk drager is van trypanosoma .Men heeft zijn bloed behandeld en dan gecentrifugeerd. De bestanddelen uit ons bloed zijn: rode bloedcellen, witte bloedcellen en het serum, deze hebben allemaal een verschillende moleculmassa. De trypanosomen leunen het dichtst aan bij de witte bloedcellen als het aankomt op moleculmassa. Daar worden ze ook opgezocht als men ze onder de microscoop wil bekijken.

Benodigdheden:

• Capilair
• Anti-coagulant
• Bloed
• Plasticine
• Centrifuge
• Afleeskamer
• Dekglaasje
• Microscoop

Werkwijze:

Wanneer men de test gaat uitvoeren is het belangrijk dat men handschoenen aandoet omdat men werkt met besmet bloed .
• Een capillair vullen met anti-coagulaat voor ¾ met bloed . Een capillair is een zeer dun buisje, het anti-coagulaat zit daar al in, anti-coagulaat zorgt ervoor dat het bloed niet gaat stollen.
• Dan moet men het droge eind van het capillair met plasticine blokkeren.
• Het capillair centrifugeren aan een snelheid van 12000 toeren gedurende 5 minuten in een haematocriet centrifuge .

• Als de centrifugatie gedaan is steekt men het capillair in een afleeskamer. De afleeskamer wordt dan gevuld en er wordt een dekglaasje opgelegd. Zo heeft men het capillair klaar gemaakt om te onder zoeken onder de microscoop.
• Nu leggen we het capillair zo dat de “buffy coat “(laag witte bloedcellen tussen het serum en de rode bloedcellen ) in de opening komt waar het licht schijnt.
• Monteer onder microscoop.
• Onderzoek op trypanosomen.(Bewegende slingers)

Waarom:

De micro hematocriet centrifigatie techniek wordt meestal gedaan als men al een vermoeden heeft dat iemand slaapziekte heeft. Na het uitvoeren van deze test is men er volledig zeker van.

Besluit:

De test is vrij eenvoudig en nog uit te voeren op het terrein(=Afrika). Men kan dan meer duidelijkheid scheppen en de test is dus wel zeer belangrijk. Om het verdere verloop van de ziekte te bepalen.

2.4 Minianion exchange centrifugatie techniek (mAECT)
Benodigdheden voor de proef:

• Kolom met gel en filter
• Buffer
• Bloedstaal
• Pipet
• Afvalbuis
• Collectiebuis
• Beschermbuis
• Proefbuis rek waar 2 buisjes onder elkaar kunnen staan.
• Centrifuge

• Afleeskamer

Werkwijze:

De kolom die in het proefbuis rek staat, die gevuld is met filter, buffer en gel, de stop ervan verwijderen. De buffer die bovenaan in de kolom is afgieten in een propere buis van 14ml.
De kolom wordt bovenaan in het proefbuis rek geplaatst. Daaronder wordt een afvalbuis geplaatst.

Op de kolom wordt nu 350 µl buffer en 350 µl bloed gebracht. Het bloed wordt eerst gemengd met de buffer zodat deze in elkaar gemengd zijn. De onderste stop van de kolom moet worden verwijderd zodat deze kan druppelen. De kolom laten lopen tot het gestopt is met druppelen. De afvalbuis verwijderen.

In de propere beschermbuis van 14 ml wordt een collectiebuis geplaatst onder de kolom.
Op de kolom wordt 3,5 ml buffer gepipetteerd. Laten lopen tot de kolom stopt met druppelen.
Wanneer het gestopt is met druppelen mag de kolom weggegooid worden.

De beschermbuis met daarin de collectiebuis wordt in de centrifuge geplaatst.
Er wordt gecentrifugeerd gedurende 10 minuten aan 3000 toeren per minuut.
Wanneer het centrifugeren is afgelopen wordt de collectiebuis uit de beschermbuis genomen en in een afleeskamer geplaatst.

De tip van de collectiebuis kan nu worden onderzocht naar enige bewegende trypanosomen onder een microscoop. De microscoop moet een vergroting van x100 hebben voor enige waarnemingen te zien.

Waarnemingen:


Na het toevoegen van de buffer en het bloed in de kolom, ontstaat er een witte vloeistof die uit de kolom druppelt in de afvalbuis.

Wanneer er opnieuw in de kolom 3,5 ml buffer wordt gepipetteerd druppelt er een witte vloeistof uit in de collectiebuis.

Na het centrifugeren is er in de collectiebuis niets veranderd van de vloeistof.
Wanneer men de tip van de collectiebuis onderzoekt naar trypanosomen, heeft men er geen terug kunnen vinden.

Verklaringen:

Wanneer er in de kolom buffer en bloed is toegevoegd wordt er vloeistof in de afvalbuis gedruppeld. Deze vloeistof bevat nog geen trypanosomen. De vloeistof kan worden weggegooid.

De vloeistof die wordt verzameld in de collectie buis bevat trypanosomen. De buffer heeft een pH 8, bij die pH heeft de gel in de kolom een positieve lading en de rode bloedcellen een negatieve lading. De gel is dus kation en de bloedcellen anion. De trypanosomen hebben bij die pH een neutrale lading. Zo kunnen de trypanosomen door de bloedcellen en de gel in de collectiebuis vloeien. De rode bloedcellen worden aangetrokken tot de gel en vloeien daardoor niet in de collectiebuis. De kolom moet nu niet meer worden gebruikt en kan worden weggegooid.

Na het centrifugeren zijn de trypanosomen in de collectiebuis gelegen in de tip, door de collectie buis in de afleeskamer te plaatsen kunnen we het onder een microscoop onderzoeken. Door de lichtfrequentie zo laag moegelijk te zetten moet men de trypanosomen niet kleuren om ze te kunnen bekijken.
Men heeft geen trypanosomen terug kunnen vinden omdat het trypanosomen zijn die gekweekt zijn op muizen. Het bloed waar de trypanosomen in waren gebracht is menselijk. Trypanosomen die schadelijk zijn voor muizen zijn niet schadelijk voor mensen. Als ze lang in menselijk bloed zitten zijn ze inactief en dood door onze antistoffen in het bloed.

Besluit:


Het mini Anion Exchange Centrifugatie Techniek (mAECT) is gebaseerd op het scheiden van trypanosomen van bloed en andere componenten. Door de techniek te gebruiken kunnen er betere onderzoeken gebeuren naar de aanwezigheid van trypanosomen. Wanneer de trypanosomen gescheiden zijn van het bloed en andere componenten is het onderzoek vergemakkelijkt.
De onderzoekers die de techniek uitvoeren hebben nu op een kleinere hoeveelheid vloeistof meerdere trypanosomen. Wanneer deze techniek niet wordt gebruikt kan het veel langer duren eer men trypanosomen gaat terugvinden.