PCR

Wat is PCR?

Het is een polymerase-kettingreactie die zeer kleine hoeveelheden DNA vermenigvulden, zodat er genoeg DNA is om het te analyseren. De PCR-reactie bestaat uit 3 verschillende stappen. RNA kan niet vermenigvuldig worden met PCR, maar wordt eerst omgeschreven in DNA, waarbij men dat DNA wel kan kopiëren.

Toepassingen

• Wordt gebruikt bij forensisch onderzoek bij een misdrijf bv: speeksel, haar, bloed,..

• Kan gebruikt worden in uiteenlopende onderzoeksdisciplines van de biologie, zoals genetica, ecologie,..

• Onderzoek naar de authenticiteit van levensmiddelen. Men kan genetische gemanipuleerde organismen aantonen.

• De basenvolgorde van het DNA kan bepaalt worden.

• In de archeologie kan men onderzoeken hoe bijvoorbeeld een mummie is overleden, want DNA is stabiel en gaat duizenden jaren mee.

• Het aantonen van de ziekteverwekker in een infectieziekte.

• In de tandheelkunde voor goede diagnostiek

PCR-buisje met benodigdheden.

 De PCR-reactie wordt meestal uitgevoerd in een PCR-buisje. Dit buisje bevat dan alle nodige bestanddelen om het DNA te multipliceren. Het stukje DNA, grote hoeveelheden van de vier nucleotide basen, een primer en DNA polymerase. De polymerase is een Taq-polymerase. Deze polymerase is vernoemd naar de bacterie Thermus aquaticus, waaruit de polymerase is geïsoleerd. Deze bacterie kan namelijk hoge temperaturen aan. Het werd gevonden doordat het de hete bron in Yellowstone overleefde. Een primer is een klein stukje DNA die zich op een specifieke DNA-code richt. De beste primer voor PCR is een korte streng, waarbij de sequentie( volgorde van de nucleotiden) overeenstemt met het te kopiëren stukje DNA.

     Werking in 3 stappen:

• Denaturatie:

De temperatuur wordt verhoogd (90°C à 96°C), waardoor de dubbele helix uit elkaar valt in twee enkelvoudige DNA strengen.

• Hybridisatie:

De temperatuur wordt verlaagd ( 45°C à 60°C), waardoor de primers zich aan de twee enkelvoudige DNA strengen hechten.

• Extensie:

Bij een temperatuur van gemiddeld 72°C, wordt door middel van DNA-polymerase de primers verlengd, waardoor twee dubbele DNA-strengen ontstaan. Het is het stuk tussen de twee primers dat vermeerderd wordt.

Deze stappen worden dan steeds opnieuw herhaald tot er genoeg DNA is om te analyseren. Een cyclus duurt ongeveer 4 minuten. Na 30 cycli zijn er al 1 miljard van de gewenste stukjes DNA gevormd.

Variant van PCR:

Realtime-PCR

Bij deze PCR techniek kan de toename van het DNA op elk moment gevolgd worden. Door middel van deze techniek wordt er een kleurstof vrij gezet bij elke vermenigvuldiging van het DNA. Daarna wordt de kleurontwikkeling gemeten en kan men de oorspronkelijke hoeveelheid DNA bepalen. Het is een goede manier om micro-organismen op te sporen. Realtime-PCR of kwantitatieve-PCR heeft een tal van voordelen. Het is nauwkeuriger, sneller, kwantitatief en er zijn minder kansen op fouten. Het is bruikbaar in immens verschillende toepassingen. Van het bepalen van het aantal kankercellen en bacteriën tot het nut in de voedselveiligheid en tumoronderzoek.