DNA isolatie van een uicel

Inleiding: We kregen als opdracht om DNA uit een uicel te isoleren en zichtbaar te maken. Dit leek ons wel leuk, omdat je nu eindelijk het mysterieuze DNA te zien zou krijgen, wat alle erfelijke eigenschappen van een organisme, en dus ook van de mens, bepaalt. We hebben twee lesuren aan dit practicum mogen werken. We zijn het practicum begonnen met het isoleren van het DNA en hebben met behulp van spiritus DNA moleculen zichtbaar gemaakt. Doel van het practicum: Hoe kan men DNA moleculen uit een uicel isoleren en vervolgens zichtbaar maken?
Benodigdheden: - Keukenzout - Afwasmiddel - 2 Uien - Bekerglas 250 ml - Water - Bekerglas 400 ml - Biotex-handwasoplossing - Staafmixer - Gekoelde spiritus - Plastic beker - Pipetteerballon - Pipet 2 ml - Reageerbuis - Reageerbuisrekje - Roerstaafje - Bak met ijsblokjes - Trechter - Koffiefilters - Maatcilinder 10 ml - Thermometer - Warmwaterbad 60 graden Celsius - Pasteurpipet - Erlenmeyer 250 ml Uitvoering: We begonnen met een oplossing te maken van 10 gram keukenzout, die voorgewogen was, met 10 ml afwasmiddel en 100 ml water in een bekerglas van 250 ml. Vervolgens sneden we twee uien zeer fijn en voegden de uien toe aan de zout-zeepoplossing in een plastic beker. Daarna maalden we dit met de staafmixer zeer fijn. We goten dit mengsel over in een bekerglas van 400 ml. Vervolgens maakten we de staafmixer en plastic beker schoon. We plaatsten dit beker glas in een warmwaterbad, van 60 graden Celsius en we verwarmden dit mengsel gedurende 15 minuten au bain marie. Tijdens het verwarmen roerden we het mengsel constant met het roerstaafje. Daarna koelden we het bekerglas met het uimengsel af in een bak met ijsblokjes gedurende 5 minuten. Ook hier bleven we met het roerstaafje roeren. We filtreerden het mengsel door een koffiefilter in een erlenmeyer van 250 ml, totdat we 100 ml filtraat hadden. We vervingen twee maal de filter, omdat hij verstopt zat. Het filtraat bevatte het DNA. Vervolgens voegden met een pipetteerballon 2 ml lauwe biotex-handwasoplossing aan het filtraat toe. We zwenkten en lieten het 1 minuut staan. We vulden twee reageerbuisjes voor de helft met het DNA mengsel. Daarna zetten we de reageerbuisjes schuin in het reageerbuisrekje. We zorgden ervoor dat ze niet bewogen. Met een pasteurpipet lieten we koude spiritus langs de wanden van de reageerbuisjes naar het mengsel lopen, zodat de vloeistoffen niet mengden. We deden dit totdat er een laagje van 2,5 cm op het DNA mengsel was ontstaan. We lieten de reageerbuisjes 3 minuten staan en wachtten totdat de DNA moleculen zich aan het oppervlak toonden. We zetten de buisjes rechtop, zodat het DNA zich naar boven verplaatsten. We wasten de overige benodigdheden af. Na een tijdje ontstonden er DNA vlokken op het oppervlak. We zorgden er tot slot voor dat alles droog en schoon was. Verklaring voor de handelingen: Het fijnmalen en snijden van de uien, was om de celmembranen, de weefsels van de ui, te breken, zodat het DNA er makkelijker uit kan. Ook diende het fijnmalen van de ui ertoe, om het zout, afwasmiddel en de biotex-handwasoplossing en zo groot mogelijk raakoppervlak te laten hebben met de uicelllen. Het zout, uit de oplossing met afwasmiddel en water, zorgde ervoor dat de celmembranen vernietigd worden. Het heeft een polariserende werking en scheidt het DNA met de andere eiwitten ui de cel. Het afwasmiddel, dat vet helpt verwijderen, helpt ook mee met het vernietigen van de celmembranen. Celmembranen bevatten namelijk lipiden, vetten. Deze worden door het afwasmiddel afgebroken. Het verwarmen diende ervoor de eiwitten, die in de uicel aanwezig waren, te denaturaliseren en het afwasmiddel beter te laten werken. Het afkoelen van het mengsel had tot functie de enzymen, die in de biotex-handwasoplossing zaten, de ideale temperatuur te geven om te werken. Het filtreren zorgde ervoor dat alle niet opgeloste deeltjes van het mengsel, gezuiverd werden uit de oplossing. Het toevoegen van de biotex-handwasoplossing diende er volgens ons voor om de eiwitten uit de oplossing te halen, en heeft dus een enzymale werking. Ook werden, door de biotex-handwasoplossing, histonen, waar DNA omheen gewikkeld is, afgebroken. De biotex-handwasoplossing moet lauw zijn, omdat de enzymen die zich in de oplossing bevinden dan hun optimum temperatuur hebben en het beste werken. De spiritus had de belangrijke functie om de DNA moleculen zichtbaar te maken. De spiritus moest koud zijn, omdat warme spiritus vervliegt en het DNA dan niet zichtbaar kan worden. De spiritus was het oplosmiddel voor het DNA. In het filtraat was het DNA niet zichtbaar, maar wanneer het in de spiritus was opgelost wel. Daarom mochten de stoffen ook niet mengen, het DNA zou dan niet meer kunnen oplossen. Waarnemingen en resultaten: We namen na het mixen waar, dat de oplossing wit was gaan schuimen en de oplossing zelf was een beetje groen grijs gekleurd. Het verwarmen zorgde niet voor echt opmerkelijke veranderingen. Het schuim bleef hetzelfde, maar de kleur werd lichtgroener en witter. Bij het afkoelen hetzelfde als bij het verwarmen. Het filtraat was dunner en het schuim ging weg. De kleur was iets geler geworden. Het schuim bleef in de koffiefilter zitten. De toevoeging van de biotex-handwasoplossing had ook geen opzienbarende zichtbare veranderingen. Na het toevoegen van de spiritus was er een duidelijk scheidingsvlak tussen de vloeistoffen te zien. Na een paar minuten waren er witte strengen in de spiritus te zien. Dit waren DNA moleculen. Conclusie: Het DNA van een cel bevindt zich in de celkern. Om dit DNA uit de kern te krijgen moeten er een paar obstakels uit de weg worden geruimd. Eerst moet de celwand van het molecuul kapot worden gemaakt. Dit is op twee manieren gedaan. De eerste op een mechanische manier: het mixen met de staafmixer. De tweede manier was een scheikundige, de zout-zeepoplossing zorgde er ook voor dat de celweefsels en veten braken. De biotex-handwasoplossing zorgde ervoor dat de overgebleven eiwitten en andere celweefsels toch nog werden afgebroken. De celresten en niet goed verpulverde stukjes ui werden door de filter tegengehouden, zodat ze niet in het filtraat een rol konden gaan spelen. De spiritus legde het DNA bloot. Dit komt doordat het DNA in de spiritus op zal lossen. Daardoor wordt het zichtbaar.
Discussie: Op zich verliep het practicum soepel. Dat kwam omdat we van te voren wisten dat we genoeg tijd zouden hebben. Hierdoor gingen we niet gehaast werken, en dat voorkwam onnodige fouten. Het filtreren gaf bij ons wat problemen, omdat de filter twee keer niet doorliep, en zelfs, toen we hem wilden vervangen een keer scheurde. Hierdoor moesten we het schuim, dat in de oplossing kwam, eruit vissen. In de toekomst is het misschien handig als iedereen een eigen warmwaterbad kan krijgen. Dit zorgt ervoor, dat het practicum sneller verloopt, en je zelfstandiger werkt. Nu hadden we dit probleem opgelost, door meerdere bekerglazen in een warmwaterbad te verwarmen. Al met al is het practicum zeer geslaagd en was de voldoening aan het eind, toen het DNA zichtbaar werd, groot. Bronnen: - Jan Bijsterbosch e.a. Nectar, Biologie 1, 2000, Wolters Noordhoff - Jan Bijsterbosch e.a. Nectar, Biologie 2, deel 2, 2002 Wolters Noordhoff - Stencil examenpracticum voorschrift, Vossius Gymnasium, 2002 - Stencil van leraren, verscheidene auteurs, Vossius Gymnasium, 2002 Interactive Media: - http://www.doultremontcollege.nl